Technika mikroskopowa może dać więcej niż większe powiększenie

Jeżeli preparat jest słabo widoczny, pierwszym odruchem bywa: "potrzebuję większego powiększenia".
 
Często problemem nie jest jednak skala, tylko niski kontrast, nieodpowiednie oświetlenie albo niewłaściwa apertura kondensora.
 
Zmiana techniki obserwacji może ujawnić więcej niż przejście z 400× na 800×.

Najważniejsze techniki

• jasne pole - bright field,
• ciemne pole - dark field,
• kontrast fazowy - phase contrast,
• oświetlenie skośne - oblique illumination,
• polaryzacja,
• DIC,
• fluorescencja.

Bright field - jasne pole

To podstawowa technika mikroskopii biologicznej. Preparat jest oświetlany od dołu, a tło jest jasne.
 
Obiekt staje się widoczny dzięki absorpcji, rozpraszaniu albo barwieniu.
 
Najlepiej sprawdza się przy:
 
• preparatach barwionych,
• tkankach,
• komórkach o naturalnym kontraście,
• większości obserwacji szkolnych.

Dlaczego żywe komórki bywają słabo widoczne w bright field?

Wiele komórek jest prawie przezroczystych i słabo absorbuje światło.
 
Można lekko przymknąć aperturę kondensora, zastosować barwienie albo poprawić ustawienie Köhlera.
 
Nie zamykamy jednak apertury do minimum, bo tracimy rozdzielczość.

Dark field - ciemne pole

W ciemnym polu bezpośrednia wiązka światła omija aperturę obiektywu.
 
Do obiektywu trafia głównie światło rozproszone albo ugięte przez preparat.
 
Efekt: jasny obiekt na ciemnym tle.

Co dobrze wygląda w dark field?

• drobne organizmy wodne,
• cienkie włókna,
• cząstki,
• krawędzie,
• słabo kontrastowe struktury.

Dark field nie zwiększa magicznie rozdzielczości

Zmienia sposób tworzenia kontrastu. Drobna struktura może stać się bardziej widoczna, ale nadal obowiązuje limit NA obiektywu i sampling kamery.

Prosty dark field

Przy małych powiększeniach można użyć centralnego stopera w kondensorze.
 
Przy wyższej NA potrzebny jest odpowiedni kondensor dark field i właściwa geometria apertur.

NA kondensora w dark field

Kondensor musi wysłać światło pod kątem większym niż ten, który akceptuje obiektyw.
 
Dlatego relacja NA kondensora ↔ NA obiektywu jest krytyczna.

Phase contrast - kontrast fazowy

Przezroczysta komórka może zmieniać fazę światła bez silnej zmiany jego amplitudy.
 
Kontrast fazowy zamienia różnice fazowe na różnice jasności.
 
Dzięki temu można obserwować żywe, przezroczyste komórki bez barwienia.

Phase contrast wymaga zgodnego systemu

Potrzebne są:
 
• obiektywy phase,
• pierścienie fazowe w kondensorze,
• poprawne centrowanie.
 
Nie jest to pojedynczy filtr dokładany do dowolnego mikroskopu.

Annulus i phase ring

Kondensor tworzy pierścieniową wiązkę, a obiektyw zawiera odpowiadający jej pierścień fazowy.
 
Oba muszą być współosiowe i właściwie dopasowane rozmiarem.

Centrowanie phase contrast

Używa się teleskopu centrującego albo optyki Bertrand, zależnie od systemu.
 
Celem jest nałożenie obrazu pierścienia kondensora na pierścień fazowy obiektywu.

Halo w phase contrast

Charakterystycznym artefaktem może być jasna lub ciemna obwódka wokół struktur.
 
Nie musi to oznaczać złej optyki - jest związane z samą metodą tworzenia kontrastu.

Oblique illumination - oświetlenie skośne

Oświetlenie jest celowo przesunięte poza oś.
 
Powstają kierunkowe cienie i asymetria kontrastu, które mogą dobrze uwidocznić krawędzie i przezroczyste struktury.

Oblique nie daje prawdziwego 3D

Obraz może wyglądać przestrzennie, ale to efekt kierunkowego kontrastu i cieniowania, a nie prawdziwej stereoskopii.

Polaryzacja

Mikroskopia polaryzacyjna wykorzystuje polaryzator i analizator.
 
Przy skrzyżowanych polaryzatorach materiały dwójłomne mogą pojawiać się jako jasne lub barwne na ciemnym tle.

Co oglądać w polaryzacji?

• kryształy,
• minerały,
• włókna,
• skrobię,
• naprężenia w tworzywach.

Polaryzacja prosta vs petrografia

Do prostych doświadczeń wystarczą dwa filtry polaryzacyjne.
 
Profesjonalna petrografia wymaga obrotowego stolika, odpowiednich obiektywów i elementów kompensacyjnych.

DIC - Differential Interference Contrast

DIC wykorzystuje polaryzację, rozdzielenie wiązki na dwie blisko siebie biegnące składowe i ich późniejszą interferencję.
 
Daje bardzo wyraźny kontrast gradientów drogi optycznej.

DIC wygląda przestrzennie, ale nie jest mapą wysokości

Charakterystyczny pseudo-relief jest obrazem gradientu optycznego, a nie bezpośrednim pomiarem topografii.

DIC wymaga zgodnego systemu

Potrzebne są polaryzatory, pryzmaty DIC i odpowiednia konstrukcja mikroskopu.
 
Nie jest to prosty dodatek jak filtr.

Fluorescencja

Preparat pochłania światło wzbudzające i emituje światło o dłuższej długości fali.
 
System wykorzystuje:
 
• filtr wzbudzający,
• lustro dichroiczne,
• filtr emisyjny.

Epifluorescencja

W typowym układzie ten sam obiektyw dostarcza światło wzbudzające i zbiera emisję fluorescencyjną.
 
Dlatego wysoka NA obiektywu jest bardzo cenna.

Filtry muszą pasować do fluoroforu

Nie istnieje jeden uniwersalny "filtr fluorescencyjny".
 
Zestaw filtrów musi odpowiadać pasmu wzbudzenia i pasmu emisji konkretnego znacznika.

Photobleaching

Fluorofor może tracić zdolność świecenia pod wpływem intensywnego wzbudzenia.
 
Dlatego ograniczamy niepotrzebną ekspozycję i dobieramy moc światła.

Fototoksyczność

W żywych preparatach intensywne światło wzbudzające może uszkadzać komórki.
 
To ważne w długotrwałych obserwacjach live-cell.

Kamera do fluorescencji

Ważne są:
 
• wysoka czułość,
• niski read noise,
• dobra wydajność kwantowa,
• mały dark current przy długich ekspozycjach.

Mono czy kolor?

Do słabych kanałów fluorescencyjnych kamera mono może być bardziej efektywna, ponieważ nie traci części światła na filtrze Bayera.
 
Kolor ma sens w dokumentacji i prostszych zastosowaniach wielobarwnych.

Köhler jest fundamentem

Niezależnie od techniki prawidłowe oświetlenie, centrowanie kondensora i ustawienie apertury mają ogromny wpływ na obraz.

Nie poprawiaj kontrastu tylko gainem kamery

Jeżeli kontrast optyczny jest słaby, podniesienie gainu rozjaśni zarówno sygnał, jak i szum.
 
Lepsza technika oświetlenia może dać znacznie większy efekt.

Technika a przygotowanie preparatu

Bright field często korzysta z barwienia.
Phase contrast dobrze działa bez barwienia.
Fluorescencja wymaga fluoroforu lub naturalnej autofluorescencji.

Technika a grubość preparatu

Gruby preparat może powodować nakładanie struktur, spadek kontrastu i problemy z wysoką NA.
 
Technika kontrastowa nie naprawi preparatu źle przygotowanego mechanicznie.

Technika a NA

Dark field wymaga odpowiedniej relacji NA kondensora i obiektywu, fluorescencja bardzo korzysta z wysokiej NA, a phase contrast wymaga dopasowanych pierścieni.
 
Zobacz Apertura numeryczna.

Technika a obiektyw

Do specjalnych metod mogą być potrzebne obiektywy PH, POL albo przeznaczone do fluorescencji.
 
Zobacz Obiektywy mikroskopowe.

Technika a kamera

Bright field zwykle daje dużo światła.
Dark field może wymagać dłuższej ekspozycji.
Fluorescencja może wymagać bardzo czułej kamery.
 
Zobacz Kamera do mikroskopu.

Nie interpretuj pseudo-3D jako wysokości

Oblique i DIC mogą dawać obraz przypominający relief.
 
Nie jest to automatycznie ilościowa mapa wysokości.

Najprostszy zestaw technik dla domu

Dobry mikroskop biologiczny może pozwolić na:
 
• bright field,
• prosty oblique,
• prosty dark field przy małych NA,
• podstawową polaryzację.

Kiedy warto phase contrast?

Jeżeli regularnie obserwujemy żywe komórki, kultury albo niebarwione mikroorganizmy.

Kiedy warto fluorescencję?

Gdy chcemy lokalizować konkretne struktury, korzystać ze znaczników fluorescencyjnych albo prowadzić bardziej zaawansowane obrazowanie biologiczne.

Kiedy warto polaryzację?

Przy minerałach, kryształach, włóknach i analizie naprężeń materiałowych.

Tabela: technika vs zastosowanie

Tabela: wymagany sprzęt

Tabela: typowy artefakt

Procedura doboru techniki

1. Oceń, czy preparat ma naturalny kontrast.
2. Jeśli jest barwiony - zacznij od bright field.
3. Jeśli jest przezroczysty i żywy - rozważ phase contrast.
4. Jeśli chcesz uwidocznić krawędzie - sprawdź dark field lub oblique.
5. Jeśli materiał jest dwójłomny - użyj polaryzacji.
6. Jeśli potrzebujesz specyficznego znacznika - fluorescencja.
7. Dopiero potem zwiększaj powiększenie.

Najczęstsze błędy

• zwiększanie powiększenia zamiast poprawy kontrastu,
• zamknięcie apertury kondensora do minimum,
• dark field przy źle dobranej NA,
• phase contrast bez centrowania pierścieni,
• traktowanie oblique jako prawdziwego 3D,
• traktowanie DIC jako mapy wysokości,
• polaryzacja bez kontroli orientacji próbki,
• fluorescencja bez dobranych filtrów,
• za duża moc wzbudzenia i photobleaching,
• kompensowanie słabego kontrastu wysokim gainem kamery.

Najważniejszy wniosek

Różne techniki mikroskopowe nie istnieją po to, aby dawać tylko "ładniejszy" obraz.
 
Każda zmienia sposób, w jaki preparat tworzy kontrast.
 
Bright field jest podstawą.
Dark field świetnie wydobywa rozpraszające drobiny.
Phase contrast jest doskonały dla żywych, przezroczystych komórek.
Polaryzacja ujawnia właściwości materiałów dwójłomnych.
DIC wzmacnia gradienty drogi optycznej.
Fluorescencja pozwala lokalizować konkretne znaczniki.
 
Najlepszy obraz powstaje wtedy, gdy technika kontrastowa + obiektyw + kondensor + preparat są do siebie dopasowane.
 
Dalsze artykuły: Jaki mikroskop wybrać?, Mikroskop biologiczny, Obiektywy mikroskopowe, Apertura numeryczna, Powiększenie mikroskopu oraz Kamera do mikroskopu.