Mikroskop biologiczny - do czego naprawde sluzy?

Mikroskop biologiczny jest przeznaczony przede wszystkim do cienkich, przezroczystych lub polprzezroczystych preparatow ogladanych w swietle przechodzacym.
 
Typowe obiekty:
 
• komorki roslinne,
• tkanki,
• preparaty histologiczne,
• pierwotniaki,
• glony,
• mikroorganizmy w kropli wody.
 
Jesli chcemy ogladac cale owady, monety, mineraly albo plytki PCB, bardziej odpowiedni bedzie mikroskop stereoskopowy.

Tor optyczny

W klasycznym ukladzie:
 
zrodlo swiatla → kondensor → preparat → obiektyw → glowica → okular lub kamera.
 
Kazdy z tych elementow wplywa na finalny obraz.

Obiektyw jest sercem mikroskopu

To obiektyw:
 
• tworzy podstawowy obraz,
• determinuje rozdzielczosc,
• okresla aperture numeryczna,
• wplywa na korekcje pola i chromatyzmu.
 
Okular glownie powieksza obraz utworzony wczesniej przez obiektyw.

Typowy zestaw 4x / 10x / 40x / 100x

4x - bardzo duze pole, wyszukiwanie preparatu.
10x - podstawowa obserwacja.
40x - drobne komorki i szczegoly.
100x oil - duza rozdzielczosc przy immersji.
 
Dla wiekszosci zastosowan edukacyjnych 4x/10x/40x wystarcza do ogromnej liczby obserwacji.

Powiekszenie calkowite

Powiekszenie calkowite = obiektyw x okular.
 
Przyklad:
 
40x x 10x = 400x.
 
Nie oznacza to jednak, ze okular 20x i obiektyw 40x dadza dwa razy wiecej szczegolow niz 10x/40x.

Apertura numeryczna - NA

Apertura numeryczna okresla zdolnosc obiektywu do zbierania swiatla pod okreslonym katem.
 
W uproszczeniu:
 
wieksza NA = wieksza mozliwa rozdzielczosc.
 
Dlatego dwa obiektywy 40x moga dawac rozna jakosc, jezeli maja inna NA, korekcje aberracji i jakosc wykonania.

Rozdzielczosc a powiekszenie

Rozdzielczosc zalezy przede wszystkim od:
 
• NA obiektywu,
• dlugosci fali,
• jakosci optyki,
• prawidlowego oswietlenia.
 
Samo zwiekszenie powiekszenia okularu nie poprawia rozdzielczosci.

Puste powiekszenie

Jesli obraz jest wiekszy, ale nie pokazuje nowych szczegolow, mamy do czynienia z pustym powiekszeniem.
 
Dlatego "2000x" nie jest dobrym kryterium wyboru mikroskopu.
 
Zobacz Powiekszenie mikroskopu.

Achromat, planachromat, plan fluor

Achromat - dobry standard edukacyjny i ogolny.
Planachromat - lepiej skorygowane pole, wazne przy fotografii i szerokim polu widzenia.
Plan fluor / fluorite - wyzsza korekcja i czesto wieksza NA.
 
Do kamery planachromat daje zwykle bardziej rownomiernie ostry obraz od centrum do brzegu.

Finite 160 mm

W klasycznym systemie finite obiektyw tworzy obraz w okreslonej dlugosci tubusa, np. 160 mm.
 
Oznaczenie typu 40/0.65 160/0.17 moze oznaczac:
 
• 40x,
• NA 0,65,
• system 160 mm,
• korekcje na szkielko nakrywkowe 0,17 mm.

Infinity

W systemie infinity wiazka po obiektywie jest kolimowana i wymaga dodatkowej tube lens.
 
Zalety:
 
• latwiejsze dodawanie filtrow i modulow,
• elastyczny tor optyczny,
• popularnosc w nowoczesnych mikroskopach laboratoryjnych.
 
Nie mieszamy przypadkowo obiektywow finite i infinity tylko dlatego, ze pasuja gwintem.

Szkielko nakrywkowe 0,17 mm

Wiele obiektywow biologicznych projektuje sie do pracy ze standardowym szkielkiem nakrywkowym okolo 0,17 mm.
 
Przy wysokiej NA grubosc szkielka moze realnie wplywac na aberracje sferyczna i ostrosc.

Obiektyw 100x oil

Obiektyw immersyjny uzywa olejku pomiedzy szkielkiem a soczewka frontowa.
 
Olejek ma wspolczynnik zalamania zblizony do szkla, dzieki czemu:
 
• wiecej swiatla trafia do obiektywu,
• mozliwa jest wyzsza NA,
• rosnie rozdzielczosc.

Jak prawidlowo uzyc 100x oil?

1. Znajdz obiekt na 10x.
2. Ustaw 40x i dokladnie wyostrz.
3. Odsun 40x.
4. Daj mala krople olejku na szkielko.
5. Obroc 100x oil w krople.
6. Uzywaj fine focus.
7. Po pracy oczysc obiektyw.

Nie zabrudz suchego 40x olejkiem

Jesli olejek trafi na suchy obiektyw 40x, obraz moze sie pogorszyc i obiektyw trzeba bedzie prawidlowo oczyscic.
 
Przy pracy immersyjnej kontrolujemy pozycje rewolweru.

Kondensor Abbego

Kondensor Abbego skupia swiatlo na preparacie i pozwala dopasowac aperture oswietlenia do obiektywu.
 
W dobrym mikroskopie powinien miec:
 
• regulacje wysokosci,
• przyslone aperturowa.

NA kondensora

Jesli uzywamy obiektywu o wysokiej NA, kondensor rowniez powinien byc w stanie dostarczyc odpowiednio szeroki stozek swiatla.
 
W przeciwnym razie obiektyw nie wykorzysta pelnego potencjalu.

Przyslona kondensora

Nie sluzy tylko do regulacji jasnosci.
 
Wplywa na:
 
• kontrast,
• rozdzielczosc,
• glebie ostrosci.
 
Zbyt mocno zamknieta zwiekszy kontrast, ale obnizy rozdzielczosc.

Oswietlenie Koehlera

Koehler pozwala uzyskac rownomierne i kontrolowane oswietlenie preparatu.
 
W praktyce ustawiamy osobno pole oswietlenia oraz aperture kondensora.
 
To standard w bardziej zaawansowanej mikroskopii i fotografii.

Jak ustawic Koehlera - skrot

1. Ustaw preparat i focus.
2. Zamknij przyslone polowa.
3. Wyostrz jej obraz kondensorem.
4. Wycentruj kondensor.
5. Otworz przyslone polowa do krawedzi pola.
6. Ustaw przyslone aperturowa odpowiednio do obiektywu.

Stolik mechaniczny XY

Przy duzych powiekszeniach jest praktycznie obowiazkowy.
 
Umozliwia precyzyjne przesuwanie preparatu w osi X i Y.
 
Bez niego latwo zgubic obiekt przy przejsciu z 10x na 40x.

Parfokalnosc

Dobrze dobrany zestaw obiektywow powinien byc w duzej mierze parfokalny.
 
Po zmianie 10x na 40x obraz powinien wymagac tylko niewielkiej korekty fine focus.

Parcentrycznosc

Przy zmianie obiektywu obserwowany detal powinien pozostac blisko srodka pola.
 
Jesli po kazdej zmianie znika z kadru, sprawdzamy centrowanie obiektywow i rewolweru.

Coarse i fine focus

Przy 4x i 10x regulacja zgrubna jest wygodna.
 
Przy 40x i 100x fine focus jest niezbedny.

Glebia ostrosci

Wraz ze wzrostem powiekszenia i NA glebia ostrosci maleje.
 
Przy 100x oil bardzo mala zmiana wysokosci preparatu moze zmienic ostrosc.

Preparat musi byc cienki

Mikroskop biologiczny nie widzi grubego obiektu tak jak stereoskop.
 
Dobre preparaty sa cienkie, plaskie i prawidlowo oswietlone od dolu.

Preparat swiezy i trwaly

Swiezy - np. kropla wody i zywe mikroorganizmy.
Trwaly - utrwalony, czesto barwiony i zamkniety pod szkielkiem nakrywkowym.

Barwienie

Wiele komorek jest prawie przezroczystych. Barwnik moze zwiekszyc kontrast wybranych struktur.
 
Nie kazda obserwacja wymaga barwienia - zywe mikroorganizmy czesto lepiej ogladac bez niego.

Kontrast fazowy

Phase contrast pozwala zobaczyc przezroczyste, niebarwione struktury przez zamiane roznic fazowych na roznice jasnosci.
 
Jest bardzo przydatny do zywych komorek, kultur i pierwotniakow.

Phase contrast wymaga systemu

Potrzebne sa:
 
• obiektywy phase,
• odpowiednie pierscienie w kondensorze,
• prawidlowe centrowanie.
 
To nie jest pojedynczy filtr do dowolnego mikroskopu.

Ciemne pole

W dark field bezposrednie swiatlo jest blokowane, a do obiektywu trafia glownie swiatlo rozproszone przez preparat.
 
Efekt: jasny obiekt na ciemnym tle.

Polaryzacja

Mikroskopia polaryzacyjna jest uzyteczna do krysztalow, wlokien, mineralow i naprezen w tworzywach.

Mono, bino, trino

Mono - najprostsza glowica.
Bino - najlepszy komfort obserwacji.
Trino - bino + staly port kamery.
 
Zobacz Mono, bino czy trino?.

Bino biologiczne nie jest stereoskopem

Oba oczy otrzymuja obraz z tego samego obiektywu.
 
Nie powstaje prawdziwa paralaksa stereo. Zyskujemy ergonomie, nie obraz 3D.

Kamera w mikroskopie biologicznym

Kamera moze sluzyc do dokumentacji, pomiarow, prezentacji obrazu i archiwizacji preparatow.
 
Najwygodniejszy jest mikroskop trino.

C-mount i reduktor

Do portu trino czesto stosujemy adapter C-mount. Reduktor 0,35x/0,5x/1x wplywa na pole widzenia i skale obrazu na sensorze.
 
Zobacz Kamera do mikroskopu.

Duzy sensor nie zawsze jest lepszy

Jesli tor trino ma male pole obrazowe, wiekszy sensor moze pokazac winietowanie i slabsze brzegi. Sensor dobieramy do pola obrazu i adaptera.

LED

Dobre oswietlenie LED powinno miec plynna regulacje jasnosci, stabilnosc i male nagrzewanie.
 
Jesli obraz jest za jasny, zmniejszamy moc LED - nie zamykamy bezmyslnie przyslony kondensora.

Jak przechodzic miedzy obiektywami?

Najbezpieczniej:
 
4x → 10x → 40x → 100x.
 
Najpierw znajdujemy obiekt na malym powiekszeniu i centrujemy go.

Nie krec coarse focus przy 100x

Przy obiektywie immersyjnym soczewka znajduje sie bardzo blisko preparatu. Duzy ruch zgrubny moze uderzyc w szkielko, uszkodzic preparat albo zabrudzic obiektyw.

Czyszczenie obiektywow

Soczewki frontowe czyscimy materialem przeznaczonym do optyki.
 
Po uzyciu 100x oil usuwamy olejek mozliwie szybko i nie zostawiamy grubej warstwy na obiektywie na wiele dni.

Mikroskop szkolny

Najbardziej uniwersalna konfiguracja:
 
• bino,
• 4x/10x/40x,
• opcjonalnie 100x oil,
• kondensor Abbego,
• stolik mechaniczny,
• fine focus,
• LED.

Mikroskop laboratoryjny

Warto szukac:
 
• plan objectives,
• systemu infinity,
• Koehlera,
• glowicy trino,
• mozliwosci phase contrast,
• dobrej ergonomii.

Tabela: obiektywy

Tabela: najwazniejsze elementy

Tabela: objaw i mozliwa przyczyna

Procedura pierwszej obserwacji

1. Wlacz LED na umiarkowana jasnosc.
2. Ustaw obiektyw 4x.
3. Poloz preparat i wycentruj.
4. Ustaw coarse focus.
5. Dopracuj fine focus.
6. Ustaw kondensor i przyslone.
7. Przejdz na 10x.
8. Wycentruj interesujacy detal.
9. Przejdz na 40x.
10. Uzywaj juz glownie fine focus.

Najczestsze bledy

• zaczynanie od 40x lub 100x,
• kupowanie po maksymalnym powiekszeniu,
• uzywanie okularu 20x zamiast lepszego obiektywu,
• zamykanie przyslony kondensora do minimum,
• brak centrowania preparatu przed zmiana obiektywu,
• uzywanie coarse focus przy 100x,
• pozostawianie olejku na obiektywie,
• mieszanie finite i infinity,
• kupowanie duzej kamery bez sprawdzenia pola trino.

Najwazniejszy wniosek

W mikroskopie biologicznym jakosc obrazu zalezy od calego ukladu:
 
obiektyw + kondensor + oswietlenie + preparat + prawidlowy focus.
 
Najwazniejsze sa nie tylko powiekszenie, ale przede wszystkim apertura numeryczna, korekcja obiektywow, jakosc kondensora i precyzja mechaniki.
 
Do szkoly i domu bardzo dobrym punktem startu jest bino 4x/10x/40x z kondensorem Abbego, stolikiem mechanicznym i fine focus. Do fotografii i laboratorium warto isc w strone planachromatow, systemu infinity, Koehlera i glowicy trino.
 
Dalsze artykuly: Jaki mikroskop wybrac?, Obiektywy mikroskopowe, Apertura numeryczna, Powiekszenie mikroskopu, Mono, bino czy trino?, Techniki mikroskopowe oraz Kamera do mikroskopu.