Apertura numeryczna - najważniejsza liczba obok powiększenia

W mikroskopii samo powiększenie mówi tylko:
 
jak duży będzie obraz.
 
Apertura numeryczna - NA - mówi znacznie więcej o tym:
 
• ile detalu obiektyw może rozdzielić,
• jak szeroki stożek światła zbiera,
• jak pracuje przy immersji,
• jak mała będzie głębia ostrości.
 
Dlatego obiektyw:
 
40× / NA 0,65
 
może być znacznie bardziej wartościowy niż obiektyw o większym nominalnym powiększeniu, ale mniejszej NA.

Definicja NA

Apertura numeryczna jest definiowana jako:
 
NA = n × sin(θ)
 
gdzie:
 
• n - współczynnik załamania medium pomiędzy preparatem a obiektywem,
• θ - połowa kąta stożka światła zbieranego przez obiektyw.

Co oznacza większy kąt θ?

Im większy kąt światła może zebrać obiektyw:
 
• tym więcej informacji przestrzennej trafia do toru,
• tym większy potencjał rozdzielczy.
 
Dlatego obiektyw o wysokiej NA zwykle:
 
• ma dużą soczewkę frontową,
• pracuje bardzo blisko preparatu.

Dlaczego powietrze ogranicza NA?

Dla powietrza:
 
n ≈ 1.
 
Ponieważ sin(θ) nie może przekroczyć 1:
 
suchy obiektyw ma praktyczną granicę NA poniżej wartości możliwych z immersją.

Dlaczego olejek zwiększa NA?

Olejek immersyjny ma współczynnik załamania zbliżony do szkła.
 
Dzięki temu część promieni, które przy przejściu:
 
szkło → powietrze
 
zostałyby silnie załamane albo utracone, może nadal trafić do obiektywu.
 
Efekt:
 
większa dostępna NA.

Typowe wartości NA

Przykładowo:
 
• 4× - około 0,10,
• 10× - około 0,25,
• 20× - około 0,40,
• 40× dry - około 0,60-0,75,
• 100× oil - około 1,20-1,30.
 
Dokładna wartość zależy od konkretnego obiektywu.

NA a rozdzielczość

Im większa NA:
 
• tym mniejszy szczegół może być rozróżniony.
 
W przybliżeniu rozdzielczość boczną można opisać relacją:
 
d ≈ 0,61 × λ / NA
 
dla kryterium Rayleigha.

Przykład dla zielonego światła

Dla λ około 550 nm:
 
przy NA 0,25:
 
d ≈ 1,34 µm.
 
Przy NA 0,65:
 
d ≈ 0,52 µm.
 
Przy NA 1,25:
 
d ≈ 0,27 µm.

Dlatego 40×/0,65 i 40×/0,40 to nie to samo

Oba dają tę samą skalę obrazu.
 
Ale obiektyw 0,65 może potencjalnie rozdzielić znacznie drobniejsze szczegóły.
 
To pokazuje, dlaczego:
 
powiększenie ≠ rozdzielczość.
 
Zobacz Powiększenie mikroskopu.

Apertura kondensora też ma znaczenie

Obiektyw nie pracuje sam.
 
Kondensor musi dostarczyć światło pod odpowiednio szerokim kątem.
 
Jeżeli kondensor ma za małą efektywną aperturę:
 
• obiektyw o wysokiej NA nie wykorzysta pełnego potencjału.

Przysłona aperturowa

Przysłona kondensora reguluje efektywną NA oświetlenia.
 
Jeżeli ją zamkniemy:
 
• wzrośnie kontrast,
• wzrośnie głębia ostrości,
 
ale:
 
• spadnie rozdzielczość.

Zbyt otwarta przysłona też może przeszkadzać

Przy bardzo szeroko otwartej aperturze:
 
• kontrast może spaść,
• refleksy mogą stać się bardziej widoczne.
 
Dlatego ustawiamy kompromis:
 
rozdzielczość ↔ kontrast.

Praktyczne ustawienie kondensora

W klasycznej pracy jasnego pola często ustawia się efektywną aperturę kondensora na część NA obiektywu, nie zawsze na 100%.
 
Prawidłowe ustawienie zależy od:
 
• preparatu,
• techniki kontrastowej,
• celu obserwacji.

NA kondensora 1,25

Kondensor o wysokiej NA może wymagać immersji między:
 
• soczewką kondensora,
• dolną powierzchnią szkiełka preparatu,
 
jeżeli chcemy wykorzystać jego pełną aperturę.

Kondensor bez immersji

Nawet kondensor oznaczony wysoką NA nie osiągnie pełnej wartości, jeśli między nim a preparatem pozostaje powietrze.
 
W typowej pracy edukacyjnej nie zawsze jest to problem, ale przy 100× oil i maksymalnej rozdzielczości ma znaczenie.

Obiektyw 100× oil i kondensor

Aby 100× / NA 1,25 pokazał pełny detal:
 
• potrzebny jest poprawny olejek,
• kondensor o wysokiej NA,
• prawidłowo ustawiona przysłona,
• dobry preparat.
 
Samo wkręcenie obiektywu 100× nie wystarczy.

NA a użyteczne powiększenie

Praktyczny zakres użytecznego powiększenia całkowitego często podaje się orientacyjnie jako:
 
500-1000 × NA.
 
To bardzo użyteczna reguła do oceny, czy dodatkowy okular rzeczywiście coś wniesie.

Przykład 10× / NA 0,25

Orientacyjny zakres:
 
• 125×-250×.
 
Z okularem 10× mamy 100× - rozsądnie blisko dolnej części praktycznego zakresu.

Przykład 40× / NA 0,65

Orientacyjny zakres:
 
• 325×-650×.
 
Okular 10× daje 400×.
 
Okular 20× dałby 800× - w wielu sytuacjach głównie większy obraz, nie więcej detalu.

Przykład 100× / NA 1,25

Zakres rzędu:
 
• 625×-1250×.
 
Z okularem 10× mamy 1000× - bardzo logiczną konfigurację.

NA a jasność obrazu

Wyższa NA pozwala zbierać światło pod większym kątem.
 
Ale rzeczywista jasność obrazu zależy również od:
 
• powiększenia,
• transmisji,
• oświetlenia,
• apertury kondensora.

Dlaczego 100× wydaje się ciemniejszy?

Mimo wysokiej NA:
 
• powiększenie jest ogromne,
• pole jest małe,
• układ jest bardziej wymagający dla oświetlenia.
 
Dlatego często trzeba zwiększyć moc LED i poprawić kondensor.

NA a głębia ostrości

Wraz ze wzrostem NA:
 
głębia ostrości maleje.
 
To dlatego przy 100× oil bardzo cienka warstwa preparatu może być ostra, a struktury lekko wyżej lub niżej już nie.

Głęboka próbka i wysoka NA

Wysoka NA daje świetną rozdzielczość boczną, ale nie oznacza dużej głębi.
 
Do obiektów przestrzennych:
 
• stereoskop,
• focus stacking
 
mogą być praktyczniejsze.

NA a working distance

Wysoka NA zwykle wymaga dużego kąta stożka i małej odległości od preparatu.
 
Dlatego:
 
• 4× ma duży WD,
• 40× znacznie mniejszy,
• 100× oil ekstremalnie mały.

NA a aberacje

Im wyższa NA:
 
• tym trudniej skorygować aberrację sferyczną,
• chromatyzm,
• wpływ cover glass.
 
Dlatego wysokiej klasy obiektywy o dużej NA są znacznie droższe.

Cover glass 0,17 mm

Przy wysokiej NA grubość szkiełka nakrywkowego zaczyna być krytyczna.
 
Obiektyw oznaczony:
 
0.17
 
jest projektowany do konkretnej grubości szkła.

Dlaczego zły cover glass szkodzi?

Przy dużym kącie promieni:
 
błąd grubości szkła powoduje różne drogi optyczne dla promieni centralnych i brzegowych.
 
Efekt:
 
• spadek ostrości,
• większa aberracja sferyczna.

Correction collar

Niektóre obiektywy wysokiej NA mają pierścień korekcyjny.
 
Pozwala skompensować:
 
• różną grubość cover glass,
• temperaturę,
• medium,
 
zależnie od konstrukcji.

NA a długość fali

Dla tej samej NA:
 
krótsza długość fali daje lepszą teoretyczną rozdzielczość.
 
Dlatego światło niebieskie ma potencjalnie większą zdolność rozdzielczą niż czerwone.

Ale nie wystarczy użyć niebieskiego LED

Trzeba uwzględnić:
 
• korekcję chromatyczną obiektywu,
• czułość oka/kamery,
• kontrast preparatu.
 
W praktyce używa się całego zaprojektowanego systemu optycznego.

NA a kamera

Jeżeli obiektyw ma wysoką NA:
 
kamera musi wystarczająco gęsto próbkować obraz, aby zarejestrować dostępny detal.
 
Zbyt duży piksel może ograniczyć zapis rozdzielczości.

Zbyt mały piksel

Nie tworzy nowego detalu ponad limit optyki.
 
Może jedynie:
 
• zwiększyć oversampling,
• wielkość plików,
• wymagania dla oświetlenia i ekspozycji.

Sampling i C-mount

Na skalę obrazu na sensorze wpływają:
 
• powiększenie obiektywu,
• tube lens,
• adapter C-mount 0,35×/0,5×/1×.
 
Zobacz Kamera do mikroskopu.

NA a kontrast fazowy

W phase contrast:
 
• obiektyw,
• pierścień kondensora
 
muszą być dopasowane.
 
Efektywna geometria apertury ma bezpośredni wpływ na poprawne działanie techniki.

NA a dark field

W ciemnym polu kondensor musi wysłać światło pod takim kątem, aby:
 
• bezpośrednia wiązka ominęła aperturę obiektywu,
• do obiektywu trafiło głównie światło rozproszone.
 
Dlatego relacja NA kondensora do NA obiektywu jest krytyczna.

NA a fluorescencja

W fluorescencji wysoka NA daje dwie duże korzyści:
 
• więcej światła wzbudzającego,
• więcej zebranego światła emisji.
 
Dlatego w tej technice bardzo często stosuje się obiektywy o wysokiej NA.

NA a szybkość obrazowania

Przy tej samej scenie wysoka NA może dostarczyć więcej sygnału do kamery.
 
Może to pozwolić:
 
• skrócić ekspozycję,
• obniżyć gain.
 
Zależy jednak od całej optyki i transmisji.

NA a focus

Wysoka NA oznacza bardzo małą tolerancję ostrości.
 
Dlatego:
 
• fine focus,
• sztywna mechanika
 
są coraz ważniejsze wraz ze wzrostem NA.

Drgania przy wysokiej NA

Nawet bardzo mały ruch:
 
• stolika,
• preparatu,
 
staje się widoczny.
 
Dlatego ciężka, stabilna podstawa mikroskopu ma realny wpływ na użyteczność wysokiego powiększenia.

NA a mikroskop stereoskopowy

W stereoskopie używamy znacznie mniejszych NA niż w mikroskopie biologicznym wysokiej rozdzielczości.
 
Zyskujemy za to:
 
• dużą głębię ostrości,
• dużą odległość roboczą,
• szerokie pole.

Dlatego stereoskop 40× i biologiczny 40× to zupełnie inne układy

Mogą mieć podobne nominalne powiększenie całkowite, ale różnią się:
 
• NA,
• rozdzielczością,
• polem,
• working distance,
• obrazem 3D.

NA a obiektywy planachromatyczne

Korekcja PLAN nie oznacza automatycznie większej NA.
 
Obiektyw PLAN może mieć:
 
• podobną NA jak achromat,
 
ale:
 
• lepiej skorygowane pole.

NA a plan fluor / apo

Wyższe klasy obiektywów często łączą:
 
• większą NA,
• lepszą korekcję chromatyczną,
• płaskie pole.
 
Dlatego są popularne w fotografii i fluorescencji.

Nie porównuj NA bez kontekstu

Obiektyw 20×/0,75 może być niezwykle zaawansowany.
 
Obiektyw 40×/0,65 może mieć mniejszą NA mimo większego powiększenia.
 
Dlatego NA i powiększenie analizujemy razem.

Tabela: przykładowe NA

Obiektyw	Przykładowa NA	Charakter pracy
4× dry	~0,10	Duże pole i duża głębia.
10× dry	~0,25	Uniwersalny zakres.
20× dry	~0,40	Dobry kompromis pola i detalu.
40× dry	~0,60-0,75	Wysoka rozdzielczość bez immersji.
100× oil	~1,20-1,30	Najwyższa typowa rozdzielczość.

Tabela: co rośnie wraz z NA?

Cecha	Przy większej NA
Rozdzielczość	Rośnie.
Zbierany kąt światła	Rośnie.
Głębia ostrości	Maleje.
Tolerancja focusu	Maleje.
Wymagania wobec cover glass	Rosną.
Wymagania wobec kondensora	Rosną.

Tabela: typowe błędy przy wysokiej NA

Objaw	Sprawdź
100× mało szczegółowy	Immersję, kondensor, cover glass.
Obraz kontrastowy, ale miękki	Czy przysłona kondensora nie jest za mocno zamknięta.
Obraz bardzo ciemny	Moc LED, kondensor, aperturę.
Focus bardzo nerwowy	To normalne przy wysokiej NA; użyj fine focus.
Kamera nie pokazuje dodatkowego detalu	Sampling i limit optyki.
Brzeg preparatu rozmyty	Cover glass / korekcję obiektywu.

Jak korzystać z NA w praktyce?

1. Porównuj obiektywy o tym samym powiększeniu po NA.
2. Dopasuj kondensor do najwyższej używanej NA.
3. Nie zamykaj przysłony do minimum tylko po to, aby zwiększyć kontrast.
4. Przy NA > 1 stosuj właściwą immersję.
5. Przy wysokiej NA zwracaj uwagę na cover glass.
6. Nie zwiększaj okularu ponad użyteczny zakres 500-1000 × NA.
7. Do kamery dobierz właściwy sampling.
8. Przy wysokiej NA oczekuj małej głębi ostrości.

Najczęstsze błędy

• ocenianie obiektywu tylko po liczbie ×,
• ignorowanie NA kondensora,
• 100× oil używane bez olejku,
• zamykanie przysłony kondensora do minimum,
• używanie niewłaściwego cover glass,
• mylenie wysokiej NA z dużą głębią ostrości,
• oczekiwanie, że mały piksel kamery zwiększy rozdzielczość ponad limit optyki,
• mylenie PLAN z wysoką NA,
• porównywanie stereoskopu i biologicznego tylko po powiększeniu,
• stosowanie bardzo dużego okularu do obiektywu o niskiej NA.

Najważniejszy wniosek

Apertura numeryczna jest jednym z najważniejszych parametrów całego mikroskopu.
 
To ona w dużej mierze określa:
 
1. rozdzielczość,
2. wymagania wobec kondensora,
3. głębię ostrości,
4. tolerancję focusu,
5. sens używania immersji.
 
Powiększenie mówi, jak duży będzie obraz. NA mówi, ile realnego detalu może w nim istnieć.
 
Dlatego dobierając obiektyw:
 
nie pytamy tylko:
 
"ile razy?"
 
ale przede wszystkim:
 
"jaką ma NA i czy cały mikroskop potrafi ją wykorzystać?"
 
Dalsze artykuły: Jaki mikroskop wybrać?, Mikroskop biologiczny, Powiększenie mikroskopu, Obiektywy mikroskopowe, Techniki mikroskopowe oraz Kamera do mikroskopu.